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原创 | 新冠病毒中和抗体的研发进展
04-02,2020

过去的一周,新冠肺炎(COVID-19)在全球快速蔓延。全球总确诊人数达到80万,传遍202个国家地区(截止3月31日),欧美成了新的疫情中心。一些高知名度人物比如哈佛大学校长,美国病毒猎手,英国首相和查尔斯王子等的新冠病毒(SARS-CoV-2)核酸检测阳性也成为上一周的媒体热点。罗氏诊断和Thermo Fisher高度自动化核酸技术上市应用,灵敏度提高到可以筛查早期无症状的病人,检测量也达到每天10万以上,美国总确诊人数上升为全球第一。总确诊人数上升未必是坏事,一定程度上说明诊断技术灵敏度准确度提高了,检测量扩大了。对于普通民众无法做到严格隔离的欧美国家,病人早筛查早隔离早治疗,可以在一定程度上抑制病毒传播。


全世界疫情的全面爆发,药物研发就非常迫切。所幸的是,各种诊疗科技的进展,正为我们带来一些药物研发可能取得突破的一些迹象。高灵敏高准确度易操作的诊断技术也使临床试验和临床观察中新冠病毒核酸转阴指标容易检测,比咳嗽发热等指标更准确,可以在短期内确定试验药物的疗效。美国NIH国家过敏和传染病研究所所长福西博士向来以严谨著称,屡次当面否定美国总统特朗普对药物研发的乐观看法。福西在3月26日的记者会,首次松口说提到他有信心目前在研的药物中会有比较有用甚至很好效果的药物。3月29日,美国FDA紧急授权羟氯喹和氯喹用于新冠肺炎病人治疗。


除了在研的抗病毒药物,针对新冠病毒中和抗体也取得不少的进步,已有多家科研机构、生物技术公司和制药公司通过不同的技术手段,获得具有病毒中和能力的单克隆抗体。本文主要介绍中和抗体研发的进展。




中和抗体简介


中和抗体是当病原微生物侵入机体时会产生并能够消除病原微生物感染能力的相应抗体。病原微生物入侵细胞时依赖病原体自身表达的关键分子(比如新冠病毒的S蛋白)与细胞上的受体结合并感染细胞,然后在细胞内进一步扩增。中和抗体由免疫系统B淋巴细胞产生并分泌入血液,通过与病原微生物表面的抗原结合,阻断该病原微生物黏附靶细胞受体,进而阻止病原微生物侵入细胞,并诱发相应的免疫反应,从而达到“中和”病原微生物的效果。


能够对冠状病毒产生中和能力的抗体主要靶向介导进入宿主细胞的病毒表面的三聚体刺突(S)糖蛋白。S蛋白具有两个功能性个亚基,介导细胞附着的S1亚基(存在四个核心结构域S1A至S1D)以及病毒和细胞膜融合的S2亚基。中和抗体通常会靶向S1亚基中的受体结合位点(Receptor binding domain, RBD),从而阻断S蛋白与受体ACE2相互结合。



图1,中和抗体(Neutralizing mAb)结合新冠病毒(SARS-CoV-2)突出蛋白(Spike Protein),阻断其与细胞受体结合

(引自hanmugaraj等,2020)


新冠病毒中和抗体制备的第一步是分离识别新冠状病毒的特异性抗体。下一步是测试这些抗体是否可以在阻止病毒感染细胞。如果抗体能起到保护细胞免于感染的作用,那么研究人员将在暴露于该病毒的动物中对其进行测试,观察中和抗体是否可以防止实验动物感染病毒,或者中和抗体是否可以改善感染新冠病毒的动物的健康状况。在实验动物上证明有效的中和抗体完成生产后,将用于临床试验。


目前已有多个新冠病毒中和抗体的开发取得较快进展。



再生元(Regeneron)


再生元(Regeneron)制药公司经过基因工程改造的小鼠具有类似于人的免疫系统,曾被用于开发埃博拉病毒中和抗体。通过这种人源化小鼠研发的另外四种药物已在市场上进行销售。再生元在人源化小鼠中接种非完整的新冠病毒并产生人中和抗体,这种中和抗体制备方法已经被包括FDA前局长斯科特·戈特利布(Scott Gottlieb)在内的专家们认为最有希望的治疗新冠肺炎新工具之一。


3月17日,再生元表示,其科学家现已分离出数百种可中和该病毒的抗体,他们正在对其进行分类,同时也从新冠肺炎康复病人中分离到人源抗体,并将两种制备方法得到高亲和力抗体组合创建鸡尾酒(Cocktail)疗法。再生元曾经制备埃博拉病毒三种中和抗体的鸡尾酒疗法,在临床试验中表现出比瑞德西韦更好的疗效。组合疗法的好处就是避免由于病毒发生突变而引起的部分抗体失效。



Vir Biotechnology


2月12日,总部位于旧金山的生物技术公司Vir Biotechnology对外宣布,实验室测试显示,该公司的两种抗体药物可以中和新冠病毒,并将继续在人体中进行检测。Vir公司获得的先导抗体具有中和新冠病毒的能力,已在两个不同的实验室得到证实。Vir公司强大的抗体技术平台用于鉴定感染性疾病幸存者体内的稀有抗体,这些抗体有可能直接中和病原体和刺激免疫系统。 Vir公司选择的抗原序列是新冠病毒与SARS病毒共有的保守区抗原表位,可以避免由于病毒突变引起的抗原表位消失。


与再生元所采取的组合抗体方法不同,Vir公司选择使用一种抗体。 但是Vir公司通过两种不同的方式对抗体Fc端进行工程化改造。 首先,通过Fc端改造,延长了抗体的体内半衰期,使抗体获得了更长的保护时间;其次,通过改造增加了抗体的短期效力。 在动物试验中,经过改造的抗体可诱导产生具有保护作用的CD8 + T细胞,具有提供长期免疫力的潜力。Vir公司生产了两种不同的中和抗体,分别带有或没有疫苗性。 该公司计划使用这两种抗体开展人体临床试验。 此外,Vir公司还筛选出与病毒其它位点结合的其它抗体,可以与先导抗体联合使用。Vir公司通过与无锡药明康德,Biogen和Xencor战略合作共同推进上述新冠病毒中和抗体的开发。



欧洲 Berend-Jan Bosch 教授课题组


3月12日,来自荷兰乌得勒支大学的 Berend-Jan Bosch 教授课题组在预印本杂志 BioRxiv上报道了人单克隆抗体阻断新冠病毒感染的研究发现。该课题组分离出了针对新冠病毒的高度中和活性的全人源单克隆抗体47D11。47D11是一种交叉中和抗体,能够结合新冠病毒和SARS病毒共同的保守表位。这项研究是中和新冠病毒的人源单克隆抗体的首次科研论文详细报道。


该课题组通过常规杂交瘤技术从免疫的H2L2转基因小鼠(Harbour Biomed,图2)开发了靶向SARS-S的杂交瘤。这些小鼠携带编码人重链和轻链免疫球蛋白库的基因,通过使用来自β冠状病毒属的三种人冠状病毒的三聚体刺突蛋白胞外域(Secto)以2周的间隔依次免疫小鼠,来诱导其产生相应抗体。



图2,人源化小鼠抗体制备

(引自Harbour Biomed网站)


获得的抗体克隆47D11可以特异结合新冠病毒和SARS病毒这两种病毒 的S蛋白的 S1 B 受体结合结构域 (RBD),亲和力类似。虽然47D11不会阻断SARS-CoV和SARS-CoV-2的S 蛋白和受体ACE2的结合,在体外实验中显示,47D1能够阻断病毒 S 蛋白与细胞的融合,抑制病毒对细胞的感染(图3)。



图3,人源抗体47D11中和SARS病毒(SARS-CoV)新冠病毒(SARS-CoV-2)

(引自 Wang et al.,2020)



中国张林琦教授课题和张政教授课题组


3月25日,清华大学医学院张林琦教授课题组与深圳市第三人民医院张政教授课题组在预印本杂志 BioRxiv报道了抗新冠病毒RBD抗体的相研究成果内容。该研究通过使用新冠病毒S蛋白抗原富集了新冠肺炎康复病人的B细胞,然后将单个B细胞分散到96孔板,通过PCR将B细胞中抗体重链和轻链基因特异性扩增并转入人293T细胞,进行单克隆筛选。通过此方法,一共从8个病人的B细胞中分离出了206种新冠病毒S蛋白特异性中和抗体,并且这些中和抗体不识别其它新冠病毒比如SARS病毒(SARS-CoV)或中东呼吸症病毒(MERS-CoV)的S蛋白的RBD。

其中来自2号病人的抗体克隆P2C-1F11和P2B-2F6与新冠病毒S蛋白中和效力最高,IC50分别小于0.1 µg/ml和1 µg/ml (图4)。各个抗体克隆中和新冠病毒的IC50参差不齐,预示没有质控的康复病人血浆治疗效果难以保证。体外竞争结合实验数据显示P2C-1F11和P2B-2F6可以阻断新冠病毒RBD和人细胞ACE2的相互结合。



图4,人源抗体中和新冠病毒(SARS-CoV-2)

(引自Ju et al.,2020)



结论与展望


中和抗体为预防和治疗新冠肺炎提供了选择。人源化小鼠,人B细胞单细胞分离和测序等技术应用,大大缩短了抗体制备时间。目前多家应用不同技术和策略的科研机构、生物技术公司、制药公司已经对外宣布了他们的开发进展,不同的技术路径展示出了各自不同的特点与优势。利用结构生物学手段揭示了受体ACE2特异性介导新冠病毒细胞侵染的结构基础,为治疗性中和抗体药物开发奠定了坚实的基础。再生元通过人源化小鼠制备单克隆抗体,并与从康复病人分离的单克隆抗体组成Cocktail。Vir生物技术公司则是对识别抗原保守表位的人源抗体进行优化改造增加半衰期和亲和力。荷兰Bosch 教授课题组选择新冠病毒与SARS病毒S蛋白上相同的一段序列作为抗原在H2L2人源化小鼠制备单克隆抗体,选择保守序列的目的是应对新冠病毒可能的突变。张林琦教授课题和张政教授课题组从康复病人血液了分离的单克隆抗体只与新冠病毒S蛋白特异性结合,不识别SARS病毒S蛋白,高亲和力的克隆可以在体外抑制新冠病毒与人细胞ACE2受体结合。除此之外,Vanderbilt大学医学中心等机构也在新闻中通报了他们通过各自的技术平台获得中和抗体,相信还有许多机构的中和抗体研发在进行中。另外也有报道来自SARS康复病人的抗体也可以交叉中和新冠病毒。来自不同康复病人的中和抗体与新冠病毒S蛋白的亲和力参差不齐,提示用康复病人的血清(非分离纯化的中和抗体)治疗新冠肺炎的疗效无法保证。


在疫苗成功研发之前,中和抗体和抗病毒药物的疗法是预防和治疗新冠肺炎的理想选择。在新冠肺炎全世界流行的紧急情况下,小分子化合物、包括中和抗体在内的生物大分子、疫苗研发都是必要的。中和抗体的动物实验模型还有些挑战,如果顺利,多家机构的中和抗体预期在暑假期间进入临床试验阶段。


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